Warning: session_name(): Cannot change session name when session is active in /home/stalko/rodina-ru.com/docs/dokuwiki/inc/init.php on line 231
Warning: session_set_cookie_params(): Cannot change session cookie parameters when session is active in /home/stalko/rodina-ru.com/docs/dokuwiki/inc/init.php on line 232
======Иммуноферментный анализ======
[{{wiki:220px-microtiter-plate.jpg|96-луночный микропланшет, используемый для ИФА.}}]**Иммуноферментный анализ** (сокращённо **ИФА**, [[Английский язык|англ.]] //enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA//) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция [[Антиген|антиген]]-[[Антитело|антитело]]. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на основные принципы аналитической химии.
ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимической реакции (т. е. [[Антитела|антитела]] связываются исключительно с определёнными [[Антиген|антигенами]], и ни с какими другими) сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки (вплоть до 10−21 моль в образце). Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации, возможность создания каскадных систем усиления различных химических сигналов, относительно низкая цена и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, микробиологическую и пищевую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования.((//А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова.// Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Издательство "Высшая школа", 1991. — С. 3-4. — [[Служебная:Источники книг/5060006441|ISBN 5-06-000644-1]].))
=====Теоретические основы=====
Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений, пептидных и стероидных гормонов, фармакологических препаратов, пестицидов, до вирусов и бактерий, и даже до других антител, — многообразия принципов связывания и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода. По одним лишь вариантам регистрации ферментативной активности возможно применение фотометрических, флуорометрических, био- и хемолюминесцентных методов, а в ряде случаев (особенно связанных с решением технологических задач) успешно применяются электрохимические и микрокалориметрические датчики.
====Физико-химические основы взаимодействия====
Иммунохимическая реакция в растворе протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса между антителами и антигенами состава 1:1 (вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением компонентов). Образование комплекса обеспечивается [[Гидрофобность|гидрофобными]], [[Ионная связь|ионными]], [[Силы Ван-дер-Ваальса|ван-дер-ваальсовыми]] и [[Водородная связь|водородными]] связями. Наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия, которые стабилизируют всю систему (уменьшают её [[Энергия Гиббса|свободную энергию]] при одновременном увеличении [[Энтропия|энтропии]]). Эффективность таких взаимодействий возрастает с повышением температуры.
В простейшем случае взаимодействие одного центра связывания антитела (//AT//) с одновалентным антигеном (//AG//) может быть представлено схемой
{\displaystyle AG+AT\rightleftharpoons AG\times AT}.
С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген-антитело характеризуется через [[Аффинность|аффинность]] антител или равновесную константу образования иммунокомплекса //Ka// (внутреннюю аффинность, л/моль):
{\displaystyle Ka={\frac {[AG\times AT]}{[AG]\times [AT]}}},
где [//AG//], [//AT//] и [//AG × AT//] — равновесные концентрации свободного антигена, свободного антитела и комплекса антиген-антитело соответственно. На практике часто используют равновесную константу диссоциации комплекса //Kd// (моль/л), связанную с Ka простым соотношением
{\displaystyle Kd={\frac {1}{Ka}}}
Очевидно, что чем меньше //Kd// (или же, наоборот, больше //Ka//), тем прочнее образующийся иммунокомплекс.
Константа комплексообразования является термодинамическим параметром, характеризующим изменение свободной энергии взаимодействия антиген-антитело, которое может быть рассчитано по формуле:
{\displaystyle \Delta F=-RT\ln Ka},
где //R// — газовая постоянная, //T// — абсолютная температура. Общее изменение свободной энергии при комплексообразовании складывается из двух термодинамических величин — изменений [[Энтальпия|энтальпии]] и [[Энтропия|энтропии]]:
{\displaystyle \Delta F=\Delta H-T\Delta S}.
Реакция антиген-антитело протекает с выделением теплоты, но, как правило, изменение энтальпии невелико и составляет около 40 кДж/моль. Изменение энтропии в большинстве случаев положительно, так как активные центры антител в свободном виде доступны растворителю и гидратированы, а при взаимодействии с антигеном из них высвобождаются связанные молекулы воды, что приводит к уменьшению общей упорядоченности системы. Таким образом, говоря об иммунологической специфичности антител, всегда проводят сравнительную оценку эффективности антиген-антитело, которое характеризуется константой равновесия или изменением свободной энергии системы при комплексообразовании.
====Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител====
Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген-антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами одной молекулы антигена, то такая характеристика образования иммунохимического комплекса является весьма упрощённой. Для описания более близкого к реальности процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном введён термин //[[Авидность|авидность]]//, или //функциональная аффинность// (//функциональное сродство//). С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.
Процесс образования комплекса антиген-антитело состава 1:1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован [[#.D0.9A.D0.BE.D0.BD.D1.81.D1.82.D0.B0.D0.BD.D1.82.D0.B0_.D0.BA.D0.BE.D0.BC.D0.BF.D0.BB.D0.B5.D0.BA.D1.81.D0.BE.D0.BE.D0.B1.D1.80.D0.B0.D0.B7.D0.BE.D0.B2.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.8F|константой комплексообразования]]. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, эффективная константа комплексообразования IgG может в 1000 и более раз превышать константу одиночных связей.
====Каталитические свойства ферментов====
Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой ферментов является их //каталитическая активность//. За единицу каталитической активности (1 каталь) любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в 1 с в реакционной смеси при определённых условиях. Для практических целей наиболее удобным является нанокаталь (10−9 кат). Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как //международная единица// (//МЕ//, англ. //U//), определённое как количество фермента, катализирующее превращение 1 ммоль субстрата в 1 мин. Соотношение между этими единицами следующее:
* ////1 нкат = 10-9 кат = 0,06 U//.//
Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют //удельную каталитическую активность//, т. е. каталитическую активность, отнесённую к единицу массы белка.
На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются:
- температура,
- природа и //pH// буфера,
- субстраты,
- [[Ферменты#.D0.9A.D0.BE.D1.84.D0.B0.D0.BA.D1.82.D0.BE.D1.80.D1.8B .D1.84.D0.B5.D1.80.D0.BC.D0.B5.D0.BD.D1.82.D0.BE.D0.B2|коферменты]],
- эффекторы,
- количество белка в системе.
Температурные зависимости имеют сложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых молекул, так и влиянием температуры на константы [[Уравнение Михаэлиса — Ментен|Михаэлиса]], константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение //pH//-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа [[Уравнение Аррениуса|Аррениуса]].
Диапазон //pH//-оптимума активности может быть весьма узким. Он зависит от ионной силы и вида используемого буфера, меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы //pH//-оптимум при температурах 37, 30 и 25 °C составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.
Определяемая каталитическая активность сильно зависит от используемого субстрата, которые могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент β-//D//-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-β-//D//-галактозид и 4-нитрофенил-β-//D//-галактозид соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.
К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, т. е. вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению скорости ферментативной реакции от линейной зависимости с количеством фермента в системе.
====Экспериментальные методы определения ферментативной активности====
==Фотометрический метод==
В ИФА наибольшее распространение получил //фотометрический метод// регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет , т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400–700 нм. Поглощение света подчиняется [[Закон Бугера — Ламберта — Бера|закону Бугера-Ламберта-Бера]], в соответствии с которым оптическая плотность раствора в определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения оптической плотности используется спектрофотометр.
==Флуориметрический метод==
В последнее время в ИФА получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые //флуориметрическим методом//. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбуждённое. Возбуждённая молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдёт в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Долю молекул, перешедших из возбуждённого состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход φ. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света, вто время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности, адсорбированные образцом. Этот факт позволяет на 1–2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.
==Биолюминесценция и хемилюминесценция==
В качестве детектирующих систем в ИФА нашли применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — //реакции био- и хемилюминесценции//. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемолюминесценции) катализируется пероксидазой хрена.
==Электрохимический метод==
Известны также //электрохимические способы// определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют определить скорость ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.
В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — от концентрации субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркёра (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента в пробе. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркёра в системе. Следует отметить, что ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, в связи с чем требование пропорциональности скорости и концентрации является скорее желательным, чем обязательным. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако же, выполнение условия пропорциональности в определённом диапазоне концентраций обеспечивает б́ольшую точность эксперимента и позволяет построить теоретическую модель с описанием метода для его оптимизации.
====Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток====
Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Если обычными спектрофотометрическими или флуориметрическими методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации 10−7 моль/л, то концентрация фермента составит при этом 10−13 моль/л. Причём принципиально возможным является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счёт увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образовавшегося продукта. В этой связи перспективными являются люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).
К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:
- высокая специфичность и удельная каталитическая активность, позволяющая обнаружить метку в низких концентрациях;
- доступность фермента, возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую активность после химической модификации при получении конъюгата с антигенами или антителами;
- стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
- простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА (где используются реагенты, иммобилизированные на поверхности твёрдых носителей) получили [[Пероксидаза хрена|пероксидаза хрена]], [[Щелочная фосфатаза|щелочная фосфатаза]] и [[Beta-galactosidase|β-D-галактозидаза]]. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций.
Наиболее доступной является пероксидаза хрена. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислению перекисью окрашенные соединения.
Каталитическую активность глюкозооксидазы регистрируют с теми же хромогенами, что и активность пероксидазы, однако чувствительность её определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента служит полное отсутствие его в плазме крови, что даёт возможность использования этого фермента в гомогенных методах ИФА (реагенты для всех стадий ИФА находятся в водном растворе).
Щелочная фосфатаза и её конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако имеет относительно высокую стоимость. Разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы [[Никотинамидадениндинуклеотидфосфат|НАДФ]]. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт [[Никотинамидадениндинуклеотид|НАД]] определяется в ферментативной системе регенерации кофактора.
β-//D//-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА. Она катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β -//D//-галактозид, при гидролизе образуются галактоза и 4-метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически.
Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ) с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450–490 нм.
=====Классификация методов ИФА=====
К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Единая чёткая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения на гетерогенные и гомогенные, т. е. по принципу проведения всех стадий анализа с участием твёрдой фазы или же только в растворе.
Первичным процессом в ИФА является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. В случае анализа антигенов для проведения такой оценки существует два подхода:
- прямое измерение концентрации образовавшихся комплексов;
- определение концентрации оставшихся свободными (не вступивших в реакцию) антител.
Очевидно, что в последнем случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа антител, оставшихся свободными.
//Классические методы ИФА// основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. К тому же, результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов ([[Гаптены|гаптенов]]), например, гормонов и лекарственных соединений, эти методы непригодны. Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. Так как процесс комплексообразования происходит в строго количественном отношении, то концентрация метки, входящей в состав комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена. Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген-антитело прочно связать (//иммобилизировать//) на твёрдом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся комплексов от свободных компонентов. Использование иммобилизации антител на твёрдом носителе положило начало методам //твердофазного (гетерогенного) ИФА//.
Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах [[Радиоиммунный анализ|радиоиммунологического анализа (РИА)]]. Введение полистирольных плат в практику ИФА позволило значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок планшеты.((//А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова.// Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Издательство "Высшая школа", 1991. — С. 5-7. — [[Служебная:Источники книг/5060006441|ISBN 5-06-000644-1]].))
В 1972 г Рубеншетейн с сотрудниками разработали новый подход с проведением всего анализа без твёрдой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА (англ. «EMIT» — enzyme multiplied immunoassay technique) и был основан на учёте различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. Суть его состоит в связывании низкомолекулярного антигена с ферментом [[Лизоцим|лизоцимом]] вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга токсических, наркотических и лекарственных средств. Существенным достоинством EMIT-анализа являются возможность использования малых объёмов анализируемого образца (5-50 мкл) и высокая скорость определения (2—5 мин), обусловленная отсутствием стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.(([[http://www.booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=egorov-am&book=1991&page=42|Теория и практика имуноферментного анализа c.42: § 7 . Гомогенные]]))
Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические [[Антитело|антитела]]), то метод является //неконкурентным//. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является //конкурентным//.
Примером //неконкурентного// формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. [[Фермент|Ферментативная]] реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается [[Спектрофотометрия|спектрофотометрически]] или визуально.
«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: [[Вирус иммунодефицита человека|ВИЧ-инфекция]], вирусные [[Гепатит|гепатиты]], [[Цитомегаловирус|цитомегаловирусная]], [[Герпес|герпесная]], токсоплазменная и другие инфекции.
Среди //конкурентных// схем твердофазного ИФА существует два основных формата:
- //Прямой конкурентный// формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические [[Антитело|антитела]], а меченый ферментом и немеченый [[Антиген|антиген]] конкурируют за связь с иммобилизованным [[Антитело|антителом]].\\
К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.\\
Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
- В //непрямом конкурентном// формате ИФА используются меченные ферментом [[Антитело|антитела]] (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат [[Антиген|антиген]]-белок-носитель.\\
Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат [[Антиген|антиген]]-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый [[Антиген|антиген]] и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого [[Антиген|антигена]].\\
Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт [[Ревматоидный фактор|ревматоидного фактора]], представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям.(([[http://xn--80agfxainapd7aj.xn--p1ai/%D0%B8%D0%BC%D0%BC%D1%83%D0%BD%D0%B8%D1%82%D0%B5%D1%82/%D1%81%D0%B8%D0%BD%D0%B4%D1%80%D0%BE%D0%BC_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BA%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D0%BE%D0%B9_%D0%B0%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2%D0%B0%D1%86%D0%B8%D0%B8/|Синдром поликлональной активации как причина ложноположительных результатов ИФА]])) Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.
=====Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов=====
В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:
- Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
- Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
- Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.
Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.
Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам).
Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% специфичностью при высокой чувствительности.
На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.
=====Перспективы и развитие метода=====
Одна из важных задач — поиск подходов, позволяющих значительно сократить время проведения анализа при сохранении высокой чувствительности. Один из таких подходов — перевод анализа в кинетический режим, что реализуется созданием автоматических устройств, основанных на проведении реакции в проточных системах.
Широкие возможности открывает использование [[Моноклональные антитела|моноклональных антител]], специфичных строго к определённому антигенному участку анализируемого соединения. Путём подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.
Метода ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самоѓо анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идёт постоянный поиск всё новых и новых ферментов, используемых в качестве маркёров. Всё возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.((//А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова.// Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Издательство "Высшая школа", 1991. — С. 5-7. — [[Служебная:Источники книг/5060006441|ISBN 5-06-000644-1]].)) Так, если до внедрения генно-инженерных методов приходилось выделять антитела из биологических сред (а хорошая очистка требует существенных затрат и времени, и реагентов, и ресурса оборудования), то в настоящее время есть возможность использовать клетки насекомого (сверчка, цикады, таракана) или [[Кишечная палочка|E. coli]] для производства требуемого рекомбинантного белка, который при сохранении требуемых биологических свойств вдобавок получается сравнительно чистым, так что его значительно проще выделить из смеси и сохранить в стабилизирующем растворе.
=====Литература=====
- Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшая школа.
- Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays. 1985, Amsterdam ; New York: Elsevier ; New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science Pub. Co. 502.
\\
{{tag>"Серологические методы" "Методы биологических исследований"}}