Warning: session_name(): Cannot change session name when session is active in /home/stalko/rodina-ru.com/docs/dokuwiki/inc/init.php on line 231

Warning: session_set_cookie_params(): Cannot change session cookie parameters when session is active in /home/stalko/rodina-ru.com/docs/dokuwiki/inc/init.php on line 232
======Полимеразная цепная реакция====== **Полимера́зная цепна́я реа́кция** (**ПЦР**) — экспериментальный метод [[молекулярная-биология|молекулярной биологии]], позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты ([[днк|ДНК]]) в биологическом материале (пробе). Помимо [[амплификация-молекулярная-биология|амплификации]] ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение [[мутация|мутаций]], сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для [[клонирование-генов|клонирования]] [[ген|генов]], выделения новых [[ген|генов]]. =====История===== В начале [[1970-е-годы|1970-х годов]] норвежский учёный [[клеппе-хьелль|Хьелль Клеппе]] из лаборатории нобелевского лауреата [[корана-хар-гобинд|Хара Гобинды Кораны]] предложил способ [[амплификация-генетика|амплификации]] ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических [[праймер|праймеров]]((Kleppe, K. et al. (1971): //Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases.// In: //J. Mol. Biol.// Bd. 56, S. 341—361. [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4927950?dopt=Abstract|PMID 4927950]])). Однако в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком [[кэри-муллис|Кэри Муллисом]]. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных [[репликация-биология|удвоений]] исходной молекулы ДНК с помощью фермента [[днк-полимераза|ДНК-полимеразы]]. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале [[science|Science]]((Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.)). Через 8 лет после этого за изобретение метода ПЦР Кэри Муллис получил [[нобелевская-премия|Нобелевскую премию]](([[http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/|Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г. (англ.)]])). В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь [[днк-полимераза|ДНК-полимеразу]], так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В [[1986-год|1986 году]] метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий((R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. //[[http://sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/009|Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase]].// in: //[[science-журнал|Science]].// 239.1988, 487—491. [[международный-стандартный-серийный-номер|ISSN]] [[http://www.sigla.ru/table.jsp?f=8&t=3&v0=0036-8075&f=1003&t=1&v1=&f=4&t=2&v2=&f=21&t=3&v3=&f=1016&t=3&v4=&f=1016&t=3&v5=&bf=4&b=&d=0&ys=&ye=&lng=&ft=&mt=&dt=&vol=&pt=&iss=&ps=&pe=&tr=&tro=&cc=UNION&i=1&v=tagged&s=0&ss=0&st=0&i18n=ru&rlf=&psz=20&bs=20&ce=hJfuypee8JzzufeGmImYYIpZKRJeeOeeWGJIZRrRRrdmtdeee88NJJJJpeeefTJ3peKJJ3UWWPtzzzzzzzzzzzzzzzzzbzzvzzpy5zzjzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzztzzzzzzzbzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzvzzzzzzyeyTjkDnyHzTuueKZePz9decyzzLzzzL*.c8.NzrGJJvufeeeeeJheeyzjeeeeJh*peeeeKJJJJJJJJJJmjHvOJJJJJJJJJfeeeieeeeSJJJJJSJJJ3TeIJJJJ3..E.UEAcyhxD.eeeeeuzzzLJJJJ5.e8JJJheeeeeeeeeeeeyeeK3JJJJJJJJ*s7defeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeSJJJJJJJJZIJJzzz1..6LJJJJJJtJJZ4....EK*&debug=false|0036-8075]] [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2448875?dopt=Abstract|PMID 2448875]])). Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий //[[thermus-aquaticus|Thermus aquaticus]]// и названа [[taq-полимераза|Taq-полимеразой]]. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' [[нуклеазы|экзонуклеазная]] активность). Полимеразы //Pfu// и //Pwo//, выделенные из [[археи|архей]], обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у //Taq//. Сейчас применяют смеси //Taq// и //Pfu//, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования. В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК) в компании [[цетус-корпорейшн|Цетус]] ([[cetus-corporation|Cetus Corporation]]), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование //Taq//-полимеразы компании [[рош-компания|Хофман-Ла Рош]] за 300 млн долларов. Однако оказалось, что //Taq//-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками [[каледин|А. Калединым]], [[слюсаренко|А. Слюсаренко]] и [[городецкий|С. Городецким]] в 1980 году((Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644—651.)), а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela.((Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557.)) В связи с этим компания [[promega|Promega]] пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент(([[http://www.roche.com/med-cor-2005-09-12|Roche announces settlement agreement with Promega]])). Американский [[патент]] на метод ПЦР истёк в марте 2005 года. =====Проведение ПЦР===== Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты [[днк|ДНК]] при помощи [[фермент|ферментов]] в искусственных условиях (//[[in-vitro|in vitro]]//). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, ([[репликация-биология|репликации]]), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки [[днк|ДНК]]. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp((1 kbp ([[kilo-base-pair|kilo base pair]] (англ.)) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины [[днк|ДНК]]))). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины [[хромосомы|хромосомной]] ДНК эукариотической клетки. Например, [[геном-человека|геном человека]] состоит примерно из 3 млрд пар оснований((Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51. [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11181995?dopt=Abstract|PMID 11181995]])). ====Компоненты реакции==== Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: * //ДНК-матрица//, содержащая тот участок ДНК, который требуется [[амплификация-генетика|амплифицировать]]. * //Два [[словарь-генетических-терминов#-d0.9f|праймера]]//, [[словарь-генетических-терминов#-d0.9a|комплементарные]] противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. * Термостабильная //[[днк-полимераза|ДНК-полимераза]]// — [[фермент]], который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — //[[thermus-aquaticus|Thermus aquaticus]]// (//Taq//-полимераза), //[[pyrococcus-furiosus|Pyrococcus furiosus]]// (//Pfu//-полимераза), //[[pyrococcus-woesei|Pyrococcus woesei]]// (//Pwo//-полимераза), //[[thermus-thermophilus|Thermus thermophilus]]// (//Tth//-полимераза) и другие. * //[[дезоксирибонуклеозид|Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты]]// (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). * Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы. * //[[буферный-раствор|Буферный раствор]]//, обеспечивающий необходимые условия реакции — [[водородный-показатель|рН]], [[ионная-сила-раствора|ионную силу раствора]]. Содержит соли, [[бычий-сывороточный-альбумин|бычий сывороточный альбумин]]. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется. Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз [[пирофосфат|пирофосфата]], побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до [[ортофосфат|ортофосфата]]. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию(([[http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php|http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php]])). ====Праймеры==== Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и [[праймер|праймерами]], короткими [[синтез-олигонуклеотидов|синтетическими олигонуклеотидами]] длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг((Отжиг ([[английский-язык|англ.]] //annealing//) — гибридизация фрагментов ДНК))), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. [[#.D0.A5.D0.BE.D0.B4_.D1.80.D0.B5.D0.B0.D0.BA.D1.86.D0.B8.D0.B8|ниже]]). Важнейшая характеристика праймеров — [[гибридизация-днк|температура плавления]] (T_m) комплекса праймер-матрица. T_m — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета T_m для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K⁺ и [[dmso|DMSO]]: T_{m}=77.1+11.7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L}}-0.75[\%DMSO],((Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz (2001). «[[http://www.clinchem.org/content/47/11/1956.full|Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas]]». //Clinical Chemistry// **47** (11): 1956-1961.)) где L — количество нуклеотидов в праймере, K⁺ — молярная концентрация ионов калия, G+C — сумма всех [[гуанин|гуанинов]] и [[цитозин|цитозинов]]. В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C. При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: * [[gc-состав|GC-состав]] ~ 40—60 %; * близкие T_m праймеров (отличия не более, чем на 5 °C); * отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек((//Шпилька// — внутримолекулярная самокомплементарная структура)) и димеров((//Димер// — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой)); * желательно, чтобы на 3’-конце был [[гуанин]] или [[цитозин]], поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной. {{wiki:пцр.png?840x434|ПЦР.PNG}} ====Амплификатор==== [{{wiki:220px-pcr-thermocycler.jpg|Амплификатор для проведения ПЦР}}]ПЦР проводят в //амплификаторе// — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные [[флуоресценция|флуоресцентным]] детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы. =====Ход реакции===== [{{wiki:220px-pcr-gel-electrophoresis.jpg|Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (первый и последний слоты) и продукты ПЦР}}]Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2). ====Денатурация==== Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (//[[денатурация-нуклеиновых-кислот|денатурацией]])//, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. ====Отжиг==== Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется //отжигом//. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60—72 °C. ====Элонгация==== ДНК-полимераза [[репликация-биология|реплицирует]] матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия //элонгации//. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы //Taq// и //Pfu// наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию //финальной элонгации//, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ — 2n, где n — число циклов реакции((Календарь РН, Сиволап ЮМ (1995). «[[file-biopolymercell1995-55-65.pdf|Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами]]». //Биополимеры и клетка// **11** (3-4): 55-65. [[issn|ISSN]] [[http://worldcat.org/issn/0233-7657|0233-7657]].)). На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)ⁿ, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла. Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в [[геометрическая-прогрессия|геометрической прогрессии]] ограничен количеством реагентов, присутствием [[ингибитор|ингибиторов]], образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». =====Разновидности ПЦР===== * **Вложенная ПЦР** ([[nested-pcr|Nested PCR]] (англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. * **Инвертированная ПЦР** ([[inverse-pcr|Inverse PCR]] (англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК [[рестриктаза|рестриктазами]] с последующим соединением фрагментов ([[лигаза#-d0-94-d0-9d-d0-9a-d0-bb-d0-b8-d0-b3-d0-b0-d0-b7-d1.8b|лигирование]]). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. * [[от-пцр|ПЦР с обратной транскрипцией]] ([[rt-pcr|Reverse Transcription PCR, RT-PCR]] (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице [[мрнк|мРНК]] синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью [[ревертазы]] и получают одноцепочечную [[кднк|кДНК]], которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда [[экспрессия-генов|экспрессируются]] данные гены. * **Асимметричная ПЦР** ([[английский-язык|англ.]] //Asymmetric PCR//) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках [[секвенирование|секвенирования]] и [[гибридизация-днк|гибридизационного]] анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является [[английский-язык|англ.]] L//inear-//A//fter-//T//he-//E//xponential-PCR// (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой ([[гибридизация-днк|температурой плавления]]), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов((Pierce KE and Wangh LJ (2007). «Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells». //Methods Mol Med.// **132**: 65–85. [[идентификатор-цифрового-объекта|DOI]]:[[https://dx.doi.org/10.1007%2F978-1-59745-298-4_7|10.1007/978-1-59745-298-4_7]]. [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17876077?dopt=Abstract|PMID 17876077]].)). * [[real-time-pcr|Количественная ПЦР]] ([[q-pcr|Quantitative PCR, Q-PCR]] (англ.)) или **[[пцр-в-реальном-времени|ПЦР в реальном времени]]** — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или [[днк-зонды|ДНК-зонды]] для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель [[sybr-green-i|Sybr Green I]] (но лучше использовать **[[http://products.invitrogen.com/ivgn/product/S7575|SYTO 13]]**), который связывается с двухцепочечной ДНК. [[sybr-green-i|Sybr Green I]] обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель //SYBR Green I// встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. //SYBR Green I// совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для //SYBR Green I// находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для //SYBR Green I// находится при длине волны 521 нм (зелёный)(([[http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html?fileId1=1305dna|Fluorescence SpectraViewer Fluorescence SpectraViewer | Life Technologies]]. Проверено 30 октября 2012.)). * **Ступенчатая ПЦР** ([[touchdown-pcr|Touchdown PCR]] (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С. * **Метод молекулярных колоний** (ПЦР в геле, [[английский-язык|англ.]] //Colony - PCR Colony//) — [[sds-page|акриламидный гель]] [[полимер|полимеризуют]] со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. * **ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК** ([[английский-язык|англ.]] //Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR//). * **ПЦР длинных фрагментов** ([[английский-язык|англ.]] //Long-range PCR//) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — //Taq//-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это //Pfu// полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как //Taq//-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где //Taq//-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к //Pfu//-полимеразе. * **[[днк-маркер|RAPD]]** ([[английский-язык|англ.]] //Random Amplification of Polymorphic DNA//), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов. * **Групп-специфическая ПЦР** ([[английский-язык|англ.]] //group-specific PCR//) — ПЦР для [[гомология-биология|родственных]] последовательностях внутри одного или между разными [[биологический-вид|видами]], используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к [[рибосомные-рибонуклеиновые-кислоты|рибосомальным 18S и 26S генам]] для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов **18S** и **26S** консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является — **уникальная ПЦР** ([[английский-язык|англ.]] //unique PCR//), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей. * **ПЦР с использованием горячего старта** ([[английский-язык|англ.]] //Hot-start PCR//) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующими антитела [[affibody-molecule|небольшими молекулами типа Affibody]], то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут. * **[[виртуальная-пцр|Виртуальная ПЦР]]** ([[английский-язык|англ.]] in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) — [[биоинформатика|математический метод компьютерного]] анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей [[праймер|праймеров]] (или [[днк-зонд|ДНК-зондов]]) для предсказания потенциальной амплификации [[днк|ДНК]] исследуемого [[геном|генома]], [[хромосом|хромосомы]], кольцевой [[днк|ДНК]] или любого другого участка ДНК. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать //вырожденные праймеры//, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: **…ATH…**, где Н — А, Т или С. =====Применение ПЦР===== ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. ====Криминалистика==== ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью [[электрофорез-днк|электрофореза ДНК]]. Полученную картину расположения полос ДНК и называют //генетическим отпечатком пальцев// ([[английский-язык|англ.]] //genetic fingerprint//). ====Установление отцовства==== [{{wiki:200px-pcr-fingerprint.png|**Рис. 3**: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.}}]Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления [[эволюция|эволюционного]] родства среди организмов. ====Медицинская диагностика==== ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и [[вирус|вирусных]] заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения [[мутации|мутаций]]. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся [[симптом|симптомы]] заболевания. ====Персонализированная медицина==== Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и [[метаболизм|метаболизме]] лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный [[цитохром]] (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным [[генотипирование|генотипированием]] ([[английский-язык|англ.]] //prospective genotyping//). ====Клонирование генов==== [[клонирование-генов|Клонирование генов]] (не путать с [[клонирование-биотехнология|клонированием]] организмов) — это процесс выделения генов и, в результате [[генная-инженерия|генноинженерных манипуляций]], получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в //вектор// — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, [[плазмида|плазмиды]] или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др. [{{wiki:pcr-clone.png|**Рис. 4**: Клонирование гена с использованием плазмиды.\\ (1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.}}] ====Секвенирование ДНК==== В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или [[радиоактивность|радиоактивным изотопом]] дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле. ====Мутагенез==== В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой. =====См. также===== * [[днк|ДНК]] * [[использование-днк-в-технологии|Использование ДНК в технологии]] * [[электрофорез|Электрофорез]] * [[днк-электрофорез|ДНК электрофорез]] * [[секвенирование|Секвенирование]] * [[секвенирование-рнк|Секвенирование РНК]] * [[real-time-pcr|Real-time PCR]] * [[методы-секвенирования-нового-поколения|Методы секвенирования нового поколения]] * [[nicking-enzyme-amplification-reaction|en: Nicking enzyme amplification reaction]] (NEAR)((United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support)) * [[иммуно-пцр|Иммуно-ПЦР]] ‎ * [[количественный-анализ-нуклеиновых-кислот#-d0-9e-d0-bf-d1-80-d0-b5-d0-b4-d0-b5-d0-bb-d0-b5-d0-bd-d0-b8-d0-b5-d0-ba-d0-be-d0-bb-d0-b8-d1-87-d0-b5-d1-81-d1-82-d0-b2-d0-b0-d0-bc-d0-be-d0-bb-d0-b5-d0-ba-d1-83-d0-bb-d0-94-d0-9d-d0-9a-d0-b8-d0-bb-d0-b8-d0-a0-d0-9d-d0-9a-d1-81-d0-ba-d0-be-d0-bd-d0-ba-d1-80-d0-b5-d1-82-d0-bd-d1-8b-d0-bc-d0-b8-d0-bf-d0-be-d1-81-d0-bb-d0-b5-d0-b4-d0-be-d0-b2-d0-b0-d1-82-d0-b5-d0-bb-d1-8c-d0-bd-d0-be-d1-81-d1-82-d1-8f-d0-bc-d0-b8-d0-bd-d1-83-d0-ba-d0-bb-d0-b5-d0-be-d1-82-d0-b8-d0-b4-d0-be-d0-b2-d1-81-d0-bf-d0-be-d0-bc-d0-be-d1-89-d1-8c-d1-8e-d1-82-d0-b5-d1-85-d0-bd-d0-be-d0-bb-d0-be-d0-b3-d0-b8-d0.b8 slipchip|Технология SlipChip]] =====Литература===== - //Глик Б., Пастернак Дж.// Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. — [[служебная-источники-книг/5030033289|ISBN 5-03-003328-9]] - //Патрушев Л. И.// Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2005. — В 2 т. — [[служебная-источники-книг/502033278x|ISBN 5-02-033278-X]] - //[[щелкунов-сергей-николаевич|Щелкунов С. Н.]]// Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.; илл. — [[служебная-источники-книг/5940870988|ISBN 5-94087-098-8]] - //Kalendar R, Lee D, Schulman AH// 2011. [[http://dx.doi.org/10.1016/j.ygeno.2011.04.009|Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis]]. Genomics, 98(2): 137—144. [[http://primerdigital.com/tools/|http://primerdigital.com/tools/]] =====Ссылки===== * [[http://epidemiolog.org/deyatelnost-pcr-laboratorii|Деятельность ПЦР-лаборатории. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности]]. * [[http://molbiol.ru/protocol/#a12|Методики, относящиеся к ПЦР, на molbiol.ru]]. * Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. [[http://www.clinchem.org/cgi/content/full/47/11/1956|Oligonucleotide Melting Temperatures under PCR Conditions: Nearest-Neighbor Corrections for Mg2+, Deoxynucleotide Triphosphate, and Dimethyl Sulfoxide Concentrations with Comparison to Alternative Empirical Formulas]]. **Clin Chem**, 47:1956-1961. {{tag>"Методы молекулярной биологии"}}